Xét Nghiệm PCR Trong Chẩn Đoán Bệnh Nhiễm Trùng

PCR (Polymerase Chain Reaction) mang nghĩa tiếng Việt là phản ứng chuỗi polymerase, trong nhiều tài liệu còn gọi là “phản ứng khuếch đại gen”, là một kỹ thuật phổ biến trong ngành sinh học phân tử.

PCR là kỹ thuật sao chép DNA trong phòng thí nghiệm, cho phép khuếch đại chọn lọc một chuỗi DNA mục tiêu mà không cần sử dụng các sinh vật sống để thực hiện. Từ một mẫu DNA nhỏ nhất, thông qua PCR, người ta có thể nhân bản và khuếch đại nó lên hàng triệu bản sao chỉ trong vài giờ.

Phương pháp căn bản chạy PCR được phát minh bởi Kary Mullis, thành tựu này giúp ông đã đoạt giải Nobel về Hóa học vào tháng 10 năm 1993, chỉ sau 8 năm khi ông đưa ra ý tưởng. Ý kiến của Mullis là phát triển một quy trình mà DNA có thể nhân lên nhiều lần một cách nhân tạo qua nhiều chu kỳ sao chép bởi enzyme DNA polymerase.

Ngày nay, PCR được sử dụng trong các nghiên cứu y – sinh học phục vụ nhiều mục đích khác nhau, như phát hiện các bệnh di truyền, nhận dạng, chẩn đoán bệnh nhiễm trùng, tách dòng gene và xác định huyết thống.

Trong chẩn đoán bệnh nhiễm trùng, kỹ thuật PCR thông qua nhân bản và khuếch đại DNA của mầm bệnh sẽ tạo ra số lượng bản sao DNA đủ lớn, làm cơ sở cho việc định danh mầm bệnh (về chủng, loài…); nói cách khác, làm cơ sở cho chẩn đoán xác định mầm bệnh. Bên cạnh đó, phân tích PCR có thể tiến hành sớm ngay sau khi nhiễm trùng, thậm chí có thể từ vài ngày đến vài tháng trước khi các triệu chứng thực tế xảy ra; nghĩa là, xét nghiệm cho phép xác định được mầm bệnh từ rất sớm, đây là ưu thế vượt trội mà các phương pháp xét nghiệm khác chưa có được; và mặc định, chẩn đoán sớm sẽ mang lại hiệu quả điều trị cao với chi phí tối ưu cho người bệnh.

Hình minh họa PCR và kiểm soát nhiễm khuẩn

NGUYÊN LÝ KỸ THUẬT PCR

NGUYÊN LÝ CHUNG

PCR là phản ứng liên quan đến quá trình khuếch đại enzyme qua trung gian DNA. PCR dựa trên việc sử dụng DNA polymerase để tổng hợp chuỗi DNA mới bổ sung cho chuỗi mẫu được cung cấp. Phản ứng cần mồi vì DNA polymerase chỉ có thể thêm một nucleotide vào nhóm 3′-OH có sẵn để thêm nucleotide đầu tiên. DNA polymerase sau đó kéo dài đầu 3 của nó bằng cách thêm nhiều nucleotide để tạo ra một vùng DNA chuỗi kép mở rộng.

THÀNH PHẦN CỦA PCR

Phản ứng PCR đòi hỏi các thành phần sau:

Mẫu DNA: DNA chuỗi kép (DSDNA) quan tâm, được tách ra khỏi mẫu.

DNA polymerase: Thường là Taq polymerase chịu nhiệt, không biến tính nhanh ở nhiệt độ cao (98°C) và có thể hoạt động ở nhiệt độ tối ưu khoảng 70°C.

Các mồi oligonucleotide: Các đoạn ngắn của chuỗi DNA đơn (thường là 20-30 cặp bazơ) bổ sung cho đầu 3 của các chuỗi cảm thụ và kháng cảm của chuỗi mục tiêu.

Deoxynucleotide triphosphate: Đơn vị cơ sở A, T, G và C (dATP, dTTP, dGTP, dCTP) cung cấp năng lượng cho phản ứng trùng hợp và các khối xây dựng để tổng hợp DNA.

Hệ thống đệm: Bao gồm magiê và kali để cung cấp các điều kiện tối ưu cho quá trình biến tính và tái tạo DNA; cũng quan trọng đối với hoạt động polymerase, tính ổn định và độ trung thực.

QUY TRÌNH PCR

Tất cả các thành phần PCR được trộn lẫn với nhau và được thực hiện thông qua chuỗi 3 phản ứng tuần hoàn chính trong một máy điều nhiệt tự động, khép kín.

1. Biến tính

Bước này liên quan đến việc làm nóng hỗn hợp phản ứng đến 94°C trong 15-30 giây. Trong thời gian này, DNA sợi kép bị biến tính thành các chuỗi đơn do bị phá vỡ trong các liên kết hydro yếu.

2. Ủ

Nhiệt độ phản ứng nhanh chóng hạ xuống 54-60°C trong 20-40 giây. Điều này cho phép các mồi liên kết (ủ) với trình tự bổ sung của chúng trong DNA mẫu.

3. Độ giãn dài

Cũng được biết đến khi mở rộng, bước này thường xảy ra ở 72-80°C (phổ biến nhất là 72°C). Trong bước này, enzyme polymerase tuần tự bổ sung các bazơ vào đầu 3′ mỗi mồi, mở rộng trình tự DNA theo hướng từ đầu 5′ đến 3′. Trong điều kiện tối ưu, DNA polymerase sẽ thêm khoảng 1.000 bp/phút.

Với một chu kỳ, một đoạn mẫu DNA sợi kép được khuếch đại thành hai đoạn DNA sợi kép riêng biệt. Hai mảnh này sau đó có sẵn để khuếch đại trong chu kỳ tiếp theo. Khi các chu kỳ được lặp lại, ngày càng có nhiều bản sao được tạo ra và số lượng bản sao của mẫu được tăng theo cấp số nhân.

Hình minh họa nguyên lý phản ứng chuỗi polymerase

CÁC LOẠI PCR

Ngoài việc khuếch đại trình tự DNA mục tiêu bằng các quy trình PCR điển hình đã được mô tả, một số loại PCR chuyên dụng đã được phát triển cho các ứng dụng cụ thể. Các loại PCR đã được phát triển gồm:

1.    Real-time PCR 2.    Quantitative real time PCR (Q-RT PCR) 3.    Reverse Transcriptase PCR (RT-PCR) 4.    Multiplex PCR 5.    Nested PCR 6.    Long-range PCR 7.    Single-cell PCR 8.    Fast-cycling PCR 9.    Methylation-specific PCR (MSP) 10.  Hot start PCR 11.  High-fidelity PCR 12.  In situ PCR

13.  Variable Number of Tandem Repeats (VNTR) PCR 14.  Asymmetric PCR 15.  Repetitive sequence-based PCR 16.  Overlap extension PCR 17.  Assemble PCR 18.  Intersequence-specific PCR(ISSR) 19.  Ligation-mediated PCR 20.  Methylation –specifin PCR 21.  Miniprimer PCR 22.  Solid phase PCR 23.  Touch down PCR, etc 24.  Các ứng dụng của PCR

ỨNG DỤNG CỦA PCR

Một số ứng dụng phổ biến của PCR trong các lĩnh vực khác nhau có thể kể đến như:

Ứng dụng trong y tế:

Xét nghiệm di truyền cho sự hiện diện của đột biến bệnh di truyền. Vd: hemoglobinopathies, xơ nang, các lỗi chuyển hóa bẩm sinh khác.

Phát hiện gen gây bệnh ở cha mẹ nghi ngờ đóng vai trò là người mang mầm bệnh.

Nghiên cứu về đột biến gen gây ung thư có thể giúp ích trong việc tùy chỉnh trị liệu.

Cũng có thể được sử dụng như một phần của xét nghiệm nhạy cảm mô ghép, rất quan trọng đối với kiểu gen cấy ghép nội tạng của phôi.

Giúp theo dõi gen trong liệu pháp gen.

Ứng dụng trong chẩn đoán bệnh nhiễm trùng:

Phân tích mẫu bệnh phẩm cho sự hiện diện của các tác nhân truyền nhiễm, bao gồm HIV, HPV, viêm gan, sốt rét, bệnh lao, vv…

Phát hiện các phân nhóm độc lực mới của sinh vật chịu trách nhiệm về dịch bệnh.

Ứng dụng trong pháp y:

PCR có thể được sử dụng như một công cụ trong dấu vân tay di truyền. Công nghệ này có thể xác định bất kỳ một người nào từ hàng triệu người khác nhau trong trường hợp: tội phạm, loại trừ nghi phạm trong quá trình điều tra của cảnh sát, xét nghiệm quan hệ cha con ngay cả trong trường hợp có thể lấy được một lượng rất nhỏ mẫu vật (vết máu, tinh dịch, tóc…).

Ứng dụng trong nghiên cứu và di truyền phân tử:

Trong nghiên cứu bộ gen: PCR giúp so sánh bộ gen của hai sinh vật và xác định sự khác biệt giữa chúng.

Trong phân tích phát sinh gen: PCR cho phép phân tích mẫu với số lượng nhỏ DNA từ bất kỳ nguồn nào như vật liệu hóa thạch, tóc, xương, mô ướp xác.

Trong nghiên cứu phân tích biểu hiện gen, đột biến gen dựa trên PCR.

Trong dự án bộ gen người: nhằm mục đích hoàn thành việc lập bản đồ gen và hiểu biết về tất cả các gen của con người…

Hệ thống PCR ProFlex của hãng Thermo Scientific

MỘT SỐ XÉT NGHIỆM PCR THƯỜNG DÙNG TRONG CHẨN ĐOÁN NHIỄM TRÙNG

XÉT NGHIỆM PCR DENGUE – CHẨN ĐOÁN SỚM SỐT XUẤT HUYẾT

Do các kháng thể IgM và IgG xuất hiện chậm nên xét nghiệm Real-time RT-PCR trở nên phương tiện rất hữu ích trong việc phát hiện nhiễm virus Dengue sớm và xác định các genotype DEN-1, DEN-2, DEN-3 và DEN-4; có thể phát hiện virus Dengue trong máu ngay từ ngày đầu tiên đến ngày thứ 5 kể từ khi xuất hiện sốt.

Kỹ thuật Real-time RT-PCR đạt độ nhạy 80-90% và độ đặc hiệu đến trên 95%. Trường hợp bệnh nhân có kết quả Realtime RT-PCR (-) tính ở 5 ngày đầu thì được coi là chưa xác định (indeterminate) và cần phải lấy mẫu máu thứ 2 sau đó 5 ngày để khẳng định có nhiễm virus Dengue hay không bằng cách định lượng Dengue IgM và IgG.

Việc xác định nhiễm virus Dengue sớm bằng kỹ thuật Real-time RT-PCR có vai trò quyết định trong chẩn đoán xác định và điều trị thành công sốt xuất huyết Dengue.

Xét nghiệm này cũng được ứng dụng để xác định sớm tình trạng nhiễm nhiều vi rút nguy hiểm khác như: HIV, HPV, HBV…

XÉT NGHIỆM PCR LAO – CHẨN ĐOÁN LAO NHANH

Lao là một nhiễm trùng do vi khuẩn Mycobacterium tuberculosis gây nên, thường gặp nhất ở phổi nhưng cũng có thể gặp ở bất cứ cơ quan nào khác như lao màng não, lao hạch, lao hệ niệu dục, xương, khớp… Xét nghiệm PCR Lao là kĩ thuật hiện đại cho phép xác định vi khuẩn lao trực tiếp trong bệnh phẩm chỉ trong vài giờ.

PCR cho phép sao chép và khuyếch đại để tạo ra hàng triệu bản sao từ 1 đoạn trình tự đặc hiệu trên genom của vi khuẩn. Trình tự phổ biến đang được sử dụng là 249 cặp bazơ nằm trên đoạn gen IS6110 của lao, đoạn gen này có tính bảo tồn cao đồng thời có tỷ lệ lặp lại từ 20-25 lần, nhờ đó làm tăng khả năng phát hiện của phản ứng. Ngoài ra, người ta còn sử dụng các trình tự đích khác để chẩn đoán như IS1081, 23S rDNA, 16S rDNA.

Trên thực tế, kỹ thuật này có thể phát hiện được vi khuẩn lao ngay cả ở nồng độ rất thấp, khoảng 1-3 vi khuẩn/mL bệnh phẩm (trong khi soi kính chỉ phát hiện được khi có khoảng 10⁵ vi khuẩn/mL bệnh phẩm). Đây là ưu điểm vượt trội so với phương pháp khác, điều này có ý nghĩa rất lớn trong việc xét nghiệm tìm vi khuẩn lao trong các mẫu bệnh phẩm như dịch não tủy, dịch ổ khớp, dịch màng tim… nơi mà lượng vi khuẩn trong đó thường rất thấp.

Xét nghiệm này cũng được ứng dụng để chẩn đoán chính xác nhiều bệnh lây truyền qua đường tình dục do vi khuẩn như: Lậu, chlamydia…

XÉT NGHIỆM PCR TRONG SÀNG LỌC, CHẨN ĐOÁN BỆNH KHÁC

QF-PCR – SÀNG LỌC TRƯỚC SINH

QF-PCR (quantitative fluorescence PCR) là xét nghiệm PCR huỳnh quang định lượng. Đây là kỹ thuật PCR khuếch đại các đoạn DNA ngắn đặc hiệu, đánh dấu bằng tín hiệu huỳnh quang và định lượng bằng điện di mao quản.

QF-PCR được dùng để kiểm tra liều gen, ví dụ: số lượng bản sao của gen trong 1 mẫu khảo sát, số lượng của các đoạn nhiễm sắc thể. Các nhiễm sắc thể thường được khảo sát bằng QF-PCR là nhiễm sắc thể 13, 18, 21, X, Y.

Hiện nay, QF-PCR thường được chỉ định trong chẩn đoán nhanh trước sinh tìm rối loạn nhiễm sắc thể cho các trường hợp thai nguy cơ cao bị Hội chứng Down, Hội chứng Edwards, Hội chứng Turner, Hội chứng Klinefelter…

Loại mẫu có thể sử dụng cho kỹ thuật này gồm: máu, dịch ối, gai nhau, dây rốn, máu dây rốn.

HLA-B27 (PCR) – CHẨN ĐOÁN VIÊM CỘT SỐNG DÍNH KHỚP

HLA (Human Leucocyte Antigen) – Kháng nguyên bạch cầu của người. HLA là một hệ kháng nguyên chủ yếu có trên bạch cầu, tiểu cầu. HLA-B27 là kháng nguyên bề mặt lớp I được mã hoá bởi locus B trên nhiễm sắc thể số 6. HLA-B27 liên quan chặt chẽ với bệnh viêm cột sống dính khớp (VCSDK). Do đó, xét nghiệm HLA-B27 đặc biệt quan trọng.

Xét nghiệm HLA-B27 bằng kỹ thuật SHPT phát hiện gen quy định kháng nguyên HLA-B27 trên nhiễm sắc thể số 6 của người ở các bệnh nhân có nguy cơ VCSDK: 90% bệnh nhân viêm cột sống dính khớp có HLA B27 dương tính và khi có mặt kháng nguyên này thì nguy cơ mắc bệnh tương đối là 90%.

Để xét nghiệm HLA-B27, cần lấy 2ml máu toàn phần chống đông EDTA để xét nghiệm trong 24 – 48 giờ, bảo quản mẫu ở 2 – 8°C.

CHI PHÍ XÉT NGHIỆM PCR CÓ ĐẮT KHÔNG?

Tùy theo mục đích và quy trình xét nghiệm, xét nghiệm PCR mỗi loại có giá cao thấp khác nhau. Giữa các cơ sở cung cấp dịch vụ xét nghiệm, giá xét nghiệm PCR chênh lệch không nhiều. Về cơ bản, giá một số xét nghiệm PCR ở mức trung như sau:

TT	TÊN XÉT NGHIỆM	GIÁ (VNĐ)
1	HBV-DNA PCR định lượng	800,000
2	HBV-DNA PCR (Roche TaqMan 48)	1,500,000
3	HPV PCR	500,000
4	PCR Dengue	500,000
5	Chlamydia – Lậu PCR	399,000
6	PCR – Lậu cầu	399,000
7	PCR dịch tìm lao	399,000
8	KST sốt rét PCR	450,000
9	HLA-B27 (PCR)	1,000,000
10	QF-PCR (Dịch ối)	3,400,000